Phos-tag SDS-PAGE データ集 ATM

ATM

Serine/threonine protein kinase which activates checkpoint signaling upon double strand breaks (DSBs), apoptosis and genotoxic stresses such as ionizing ultraviolet A light (UVA), thereby acting as a DNA damage sensor.
Mw; 350,000

泳動結果

ATMは高分子量(350 kDa) であるため，
3％という低濃度のポリアクリルアミドゲルを用いて解析しています。
3％ではゲルが柔らかすぎて扱いにくいため，
0.5％アガロースを加えて補強しています。

HeLa細胞血清存在下で培養し，
actinomycin(2µM)を添加して5時間後にATMのリン酸化状態を
Phos-tag SDS-PAGEで解析しています。

Zn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEの場合は，通常ゲルバッファーはBis-trisです。
しかし，Bis-trisは３級アミンであり，TEMEDと同じ重合開始剤として
一部がポリアクリルアミドに重合します。
ゲル濃度が高い場合は問題になりませんが，
3%では，Bis-trisのポリマー化の影響を受けて，
低質なゲルができ，タンパク質の分離ができません。

そこで，Tris-酢酸 (200 mM) を分離ゲルバッファーに，
Tirs-Tricineを泳動バッファーに用いることで，
高分子解析用，低濃度ゲルのZn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEを実現しました。

ATMをサンプルとして，この系の分離効果を
Mn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEと比較した実験です。

Mn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEでは，リン酸化型を2種分離しましたが
Zn²⁺–Phos-tag SDS-PAGE では，3種分離しました。

一概に言えませんが，Zn²⁺–の方が，Mn²⁺–よりも分離効果が高い傾向があり，
ATMもその一例です。

ATM

泳動結果

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